Peter Parker (Tobey Maguire) har äntligen sina drömmars tjej, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) och New York lider av Spider-mani! Men när en underlig utomjordisk symbiot gör Spider-Mans dräkt svart kommer hans mörkaste demoner ut i ljuset och förändrar både Spider-Mans inre och yttre. Spider-Man står inför sitt livs strid mot en livsfarlig skurkblandning - den dödlige Sandman (Thomas Haden Church), Venom (Topher Grace) och New Goblin (James Franco) - utöver fienden inom sig.