Peter Parker (Tobey Maguire) har endelig fået sin drømmepige Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), og New York City går amok i Spider-mania! Men en mystisk udenjordisk symbiot gør Spider-Mans dragt sort og vækker hans mørkeste dæmoner til live, og Spider-Man forvandles både indeni og udadtil. Spider-Man står overfor sit livs kamp mod en dødbringende blanding superskurke - den dødsensfarlige Sandman (Thomas Haden Church), Venom (Topher Grace), New Goblin (James Franco), såvel som fjenden i hans eget indre.