Een donkerharige vrouw krijgt midden in de nacht een ongeluk op Mulholland Drive in Los Angeles en verliest daardoor haar geheugen. Verward loopt ze terug naar de stad en overnacht in een leegstaand appartement. De volgende dag wordt ze daar gevonden door Betty Elms, een jonge actrice die net naar Hollywood is verhuisd met de bedoeling het daar te gaan maken. De donkerharige vrouw weet niet hoe ze heet, maar besluit zichzelf Rita te noemen omdat ze de naam Rita Hayworth op een filmposter ziet staan. Betty en Rita proberen samen te reconstrueren wat er met Rita gebeurd is. Er ontwikkelt zich een lesbische relatie tussen beiden. Ondertussen gebeuren er vreemde dingen, die zeker op het eerste gezicht geen verband lijken te houden met de hoofdlijn. Een man vertelt over een nachtmerrie die vervolgens werkelijkheid wordt, filmregisseur Adam Kesher wordt bedreigd door de maffia, er vindt een ontmoeting met een geheimzinnige cowboy plaats en een onervaren crimineel steelt een 'black book'. De film wordt hoe langer hoe meer bizar en onnavolgbaar totdat alle verhaallijnen ineens stoppen en er een nieuwe film lijkt te beginnen. Naomi Watts speelt nu de geflopte actrice Diane Selwyn, die ongelukkig is met haar leven. Haar partner Camilla heeft haar verlaten voor gevierd regisseur Adam Kesher. Boos, vernederd en ten einde raad huurt Diane iemand in om Camilla te laten vermoorden en ze pleegt uiteindelijk zelfmoord.
